賽默飛VeritiPro384孔梯度PCR儀出現(xiàn)部分孔無(wú)擴(kuò)增（其他孔正常）的情況，請(qǐng)按以下步驟系統(tǒng)排查。注意：先確認(rèn)無(wú)擴(kuò)增孔是否具有規(guī)律性（如邊緣、特定列/行、或隨機(jī)分布），這能快速指向原因。

一、檢查樣品與試劑操作問(wèn)題

384孔板加樣量小（通常5–20μL），易發(fā)生加樣遺漏、蒸發(fā)或封膜不嚴(yán)。

1、復(fù)查加樣記錄：確認(rèn)無(wú)擴(kuò)增孔是否恰好是某些引物/模板/酶缺失的孔?？芍匦逻\(yùn)行這些孔的反應(yīng)（單管或小批量）驗(yàn)證。

2、檢查封膜與熱蓋：

（1）使用適配384孔板的光學(xué)透明封膜，并用力壓實(shí)，避免邊緣翹起。

（2）確保熱蓋溫度設(shè)為105°C左右，且熱蓋旋鈕（若有）擰緊，使熱蓋均勻壓住板面。

（3）觀察反應(yīng)后液面：若某些孔液面明顯下降，說(shuō)明蒸發(fā)導(dǎo)致失敗。邊緣孔最容易蒸發(fā)。

3、檢查384孔板質(zhì)量：

（1）推薦使用Applied Biosystems（賽默飛）或同類優(yōu)質(zhì)384孔板，確保底部薄且平整。

（2）板子變形或不平會(huì)導(dǎo)致部分孔與加熱塊接觸不良。

二、分析無(wú)擴(kuò)增孔的分布規(guī)律

在實(shí)驗(yàn)記錄紙上標(biāo)記384孔板的陽(yáng)性/陰性分布圖：

1、邊緣孔（第一/最后一行或列）無(wú)擴(kuò)增 → 極可能是熱蓋壓力不均或邊緣蒸發(fā)。解決方法：使用帶墊片的384孔板或在板四周加無(wú)菌水填充空余孔（平衡壓力），或更換專用384孔熱蓋墊。

2、連續(xù)多列或整行無(wú)擴(kuò)增 → 可能對(duì)應(yīng)加熱模塊的某條控溫通道故障，或該區(qū)域有污染物/氣泡。

3、隨機(jī)散在分布 → 多為加樣錯(cuò)誤、試劑混合不均、或個(gè)別孔封膜破損。

三、儀器硬件與溫度均勻性驗(yàn)證

VeritiPro的384孔模塊實(shí)際由多個(gè)半導(dǎo)體片組成，可能出現(xiàn)局部溫度偏差。

1、運(yùn)行溫度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（使用熒光染料）：

（1）配制含ROX或FAM染料（無(wú)淬滅）的PCR預(yù)混液，分裝至所有孔。

（2）運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR程序（例如95°C變性，60°C延伸，不設(shè)循環(huán)）。在60°C階段采集熒光圖像。

（3）正常情況所有孔熒光值應(yīng)一致。若某區(qū)域熒光明顯偏低，說(shuō)明該區(qū)域溫度異常（溫度過(guò)高導(dǎo)致染料淬滅或揮發(fā)？實(shí)際更可靠的是使用溫度探針板，但用戶通常沒(méi)有）。

2、梯度功能的影響：

若程序設(shè)置了梯度，確認(rèn)無(wú)擴(kuò)增孔是否落在梯度的高溫或低溫區(qū)域。重新計(jì)算梯度范圍內(nèi)有效退火溫度，必要時(shí)縮小梯度跨度。

3、檢查加熱模塊表面：

關(guān)閉儀器，打開(kāi)熱蓋，用無(wú)塵布蘸取70%乙醇輕輕擦拭384孔模塊表面，去除干涸的試劑或灰塵（殘留物會(huì)阻礙熱傳導(dǎo)）。

四、運(yùn)行儀器自檢與校準(zhǔn)

VeritiPro內(nèi)置自檢程序：

1、進(jìn)入儀器主界面 → Settings → Service（可能需要密碼，默認(rèn)為1234或聯(lián)系技術(shù)支持） → 運(yùn)行 Block Diagnostic 或 Temperature Verification。

2、查看是否有錯(cuò)誤代碼或溫度超差報(bào)警。

3、執(zhí)行“熱蓋壓力校準(zhǔn)"（如果儀器提供該選項(xiàng)）：部分VeritiPro可調(diào)整熱蓋下壓行程，確保384孔板所有位置受力均勻。

五、耗材與方案替代測(cè)試

1、更換耗材品牌：嘗試使用另一盒新的384孔板（不同批次），避免板底厚度不均。

2、縮小反應(yīng)體積：若當(dāng)前用20μL，可嘗試10μL，減少蒸發(fā)風(fēng)險(xiǎn)并改善熱傳導(dǎo)。

3、運(yùn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)：

取同一混合反應(yīng)液，分裝到96孔板（用普通PCR儀）和384孔板（用VeritiPro）。若96孔板全部正常，而384孔板仍有部分無(wú)擴(kuò)增，則問(wèn)題在于384孔板或儀器384孔模塊。

六、緊急處理建議（維持實(shí)驗(yàn)進(jìn)行）

1、避開(kāi)故障區(qū)域：若確認(rèn)某幾列/行始終失敗，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)只使用正常區(qū)域（如只使用中間60列），但會(huì)損失通量。

2、使用熱蓋壓力墊片：從賽默飛購(gòu)買(mǎi)384孔板專用的熱蓋適配墊，能改善邊緣孔壓力。

3、改用96孔模塊（若VeritiPro支持模塊更換）：臨時(shí)更換為96孔模塊完成實(shí)驗(yàn)。

4、先排除蒸發(fā)和封膜問(wèn)題。對(duì)于384孔板，邊緣孔無(wú)擴(kuò)增在超過(guò)80%的案例中是由于熱蓋壓力不足或封膜不嚴(yán)導(dǎo)致的蒸發(fā)。請(qǐng)?jiān)跓嵘w上額外放置一塊平整的硅膠墊或使用帶邊框的384孔板，往往能直接解決問(wèn)題。