伯樂（Bio-Rad）垂直電泳槽（型號(hào)1658004，通常為Mini-PROTEAN Tetra系統(tǒng)組件）出現(xiàn)條帶分叉（單個(gè)預(yù)期條帶分裂為兩條，或呈“Y"形、雙峰狀），請(qǐng)按以下優(yōu)先級(jí)排查處理。

一、蛋白質(zhì)還原不充分（約占50%）

1、表現(xiàn)

（1）非還原狀態(tài)下，含二硫鍵的蛋白出現(xiàn)兩條帶（單體和二聚體/多聚體）。

（2）還原條件下，分叉條帶仍存在，尤其在高分子量區(qū)域。

2、處理

（1）增加還原劑濃度：上樣緩沖液中的DTT終濃度提高到100 mM（常規(guī)為50-100 mM），或β?巰基乙醇提高到5-5%。

（2）加熱變性：95-100℃加熱5-10分鐘，冷卻后再上樣。對(duì)難溶蛋白可延長(zhǎng)至10-15分鐘。

（3）新鮮配制還原劑：DTT或β-ME易氧化，分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

二、凝膠聚合不均勻（約占25%）

1、表現(xiàn)

（1）分叉出現(xiàn)在所有泳道的同一位置，且有時(shí)伴隨條帶彎曲或波浪形。

（2）重復(fù)制膠后分叉位置或程度變化。

2、處理

（1）充分混勻凝膠溶液：加入TEMED和APS后，渦旋震蕩10秒以上，立即灌膠。

（2）APS現(xiàn)配現(xiàn)用：10%過硫酸銨在4℃保存不超過1周，每次新鮮配制。

（3）避免氣泡：灌膠時(shí)動(dòng)作輕柔，插入梳子時(shí)防止氣泡滯留在梳齒下方。

（4）控制聚合溫度：室溫太低（<20℃）可延長(zhǎng)聚合時(shí)間，過高（>30℃）會(huì)導(dǎo)致聚合過快不均勻。

三、電泳條件不當(dāng)（約占15%）

1、表現(xiàn)

（1）分叉在低電壓下減輕，高電壓下加重。

（2）同時(shí)伴有條帶拖尾或“微笑"現(xiàn)象。

2、處理

（1）降低電壓/電流：推薦濃縮膠80 V，分離膠120 V（恒壓）。或使用恒流（10-20 mA/板）。

（2）置于冰浴或冷室：過熱會(huì)導(dǎo)致凝膠局部變性速率差異，引起分叉。

（3）使用新鮮電泳緩沖液：舊的緩沖液pH漂移或SDS沉淀，可替換新液。

四、加樣孔或樣品雜質(zhì)干擾（約占10%）

1、表現(xiàn)

（1）分叉僅出現(xiàn)在個(gè)別泳道。

（2）上樣孔內(nèi)有不溶顆粒或脂類。

2、處理

（1）清洗加樣孔：拔梳后用1×電泳緩沖液沖洗每個(gè)孔，去除未聚合的丙烯酰胺碎片。

（2）樣品離心：上樣前12,000 rpm離心5分鐘，取上清，避免沉淀物堵塞孔底。

（3）避免高濃度去垢劑：樣品中SDS終濃度不宜超過2%。

五、蛋白自身修飾或降解

1、表現(xiàn)

（1）分叉條帶寬度與原條帶相似，且隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)變得更明顯。

（2）使用新鮮制備的樣品分叉消失。

2、處理

（1）加入蛋白酶抑制劑（如PMSF、cOmplete™ cocktail）。

（2）分裝保存，避免反復(fù)凍融。

（3）檢查是否發(fā)生磷酸化、糖基化等修飾：如需確認(rèn)，可用磷酸酶或去糖基化酶處理樣品看分叉是否合并。

六、快速診斷流程

1、跑一個(gè)強(qiáng)還原、新鮮變性的標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker（如預(yù)染Marker，已知無分叉）

結(jié)果：Marker也分叉

處理：凝膠或電泳系統(tǒng)問題：重新配膠、換緩沖液、降電壓

2、Marker正常，僅目的蛋白分叉

結(jié)果：樣品問題

處理：增加還原劑、加熱時(shí)間、離心上清

3、分叉僅出現(xiàn)在高分子量區(qū)域

結(jié)果：可能為二聚體或降解產(chǎn)物

處理：做非還原/還原對(duì)比；增加還原劑

4、更換另一臺(tái)電泳槽和電源

結(jié)果：分叉消失

處理：原設(shè)備電極絲或連接不良，需檢修

七、總結(jié)

先跑Marker——若Marker分叉，問題在凝膠或電泳條件（重配膠、降電壓、換新緩沖液）；若Marker正常，則樣品的還原或純度是主因（加大DTT、加熱、離心）。