賽默飛（Thermo Fisher）的自動細胞計數儀（以 Countess 系列為主，如 Countess II、Countess 3、Countess 3 FL）在實驗室中使用非常普遍。用戶在實際操作中遇到的技術性問題通常集中在成像質量、算法識別、樣本制備和硬件維護四個方面。以下是常見問題及可能原因的系統梳理：

一、成像相關問題（圖像模糊、亮度異常、有雜質）

1、圖像整體模糊，細胞邊緣不清晰

技術原因：

（1）未正確對焦：Countess II 是固定焦距（依賴玻片卡槽精度），若玻片未推入或卡槽內有異物，會導致焦距偏移。

（2）鏡頭臟污：物鏡表面有灰塵、指紋或殘留的臺盼藍結晶。

（3）玻片質量問題：反復使用的玻片劃痕嚴重或底部不透明。

2、圖像過亮或過暗，細胞不可見

（1）照明LED老化或亮度設置不當（部分型號可手動調節曝光/增益）。

（2）臺盼藍濃度過高：染色過深，吸光太強，導致活細胞區域全黑。

（3）未使用臺盼藍但選擇了“活率"模式。

3、視野中出現大量氣泡、纖維或塊狀物

（1）樣本未充分混勻，或有沉淀。

（2）玻片注入時產生氣泡，算法會誤判為細胞碎片。

（3）培養液中的蛋白或血清絮狀物未去除。

二、計數和活率識別錯誤（算法問題）

這是用戶最常抱怨的技術痛點，尤其在處理團塊細胞、不規則細胞或低活性樣本時。

1、細胞團塊被計為單個細胞，或團塊被忽略

算法：默認的“細胞分割"算法對緊密連接的細胞團分辨率有限。即便調節“細胞直徑范圍"和“團塊分離強度"參數，仍可能失效。

2、臺盼藍染色細胞活死判別不準

算法：

（1）染料與細胞比例不當：臺盼藍終濃度應為0.2-0.4%，過濃會使活細胞也被染成淺藍色。

（2）細胞染色時間過長（>5分鐘）：活細胞也會吸收染料，導致假陽性死亡。

（3）死細胞破裂：碎片與臺盼藍結合，被誤判為死細胞。

3、小細胞（如PBMC、原代神經元）被漏計

算法：默認的細胞尺寸下限（通常4-6 μm）過濾掉了更小的細胞。用戶需手動設置“最小細胞直徑"。

4、細胞碎片或灰塵被誤計為細胞

算法：背景噪聲閾值設置過低。在“高級設置"中提高“亮度閾值"可減少誤計。

5、活率結果忽高忽低，重復性差

算法：

（1）樣本上樣前未充分吹打混勻。

（2）同一個玻片的不同視野差異大（細胞沉降不均）。

（3）儀器未進行背景校正（某些型號需要定期做空白校正）。

三、硬件及耗材相關故障

1、儀器無法啟動、屏幕不亮

原因：電源適配器損壞、保險絲燒斷、內部電池（如有）耗盡。

2、玻片無法被識別或卡滯

原因：玻片尺寸不標準（非原裝耗材）；卡槽內有殘留膠水或碎屑；傳感器臟污。

3、計數結果總顯示“誤差過高"或“濃度超出范圍"

原因：細胞濃度過高（>1e7/mL）或過低（<1e4/mL），超出線性范圍。建議稀釋或濃縮后再測。

4、聚焦后圖像邊緣模糊

可能是鏡頭組件松動或載物臺不平，需要專業校準。

四、軟件與數據管理問題

1、無法保存圖像或導出數據：USB端口故障、U盤格式不兼容（需FAT32）、固件版本過低。

2、自定義細胞類型參數丟失：Countess 3 支持保存多個實驗模板，但若用戶未正確保存或儀器恢復出廠設置，參數會丟失。

3、Wi-Fi/網絡連接失敗（僅限Countess 3 FL等支持云功能的型號）：網絡配置錯誤或防火墻阻攔。

五、用戶操作不當導致的“偽技術問題"

這些不是儀器本身的故障，但常被誤認為是技術問題：

1、加樣前未將細胞吹打成單細胞懸液

后果：計數結果嚴重偏低，活率假性降低（因為團塊中央細胞染不上臺盼藍）。

2、用酒精或強酸清潔鏡頭

后果：損壞鏡頭鍍膜，導致模糊。

3、使用非專用計數板（如血球計數板）

后果：Countess 系列只能使用專用一次性玻片，否則無法對焦和識別。

4、樣本中混有磁珠或微載體

后果：被計為細胞，嚴重干擾結果。

六、如何快速排查技術問題（實用步驟）

1、對照標準品：使用儀器附贈的質控微球（已知濃度和活率）檢測儀器是否準確。若質控正常，則問題出在樣本制備。

2、清潔鏡頭和玻片卡槽：用鏡頭紙 + 70%異丙醇輕輕擦拭物鏡，用棉簽清理卡槽邊緣。

3、調整成像參數：在手動模式下調節亮度、曝光時間、增益，直到細胞與背景對比清晰。

4、優化算法設置：

（1）設置合適的細胞直徑范圍（如CHO細胞 10-35 μm，HEK293 8-25 μm）。

（2）開啟或關閉“團塊分離"功能。

（3）調整“背景閾值"去除碎片干擾。

5、驗證染色：在顯微鏡下目視觀察同一份樣本的臺盼藍染色情況，確認細胞活率與儀器結果大致相符。

七、總結：常見且難解決的技術問題

1、細胞團塊導致計數偏低 – 沒有算法解決方案，只能在實驗前優化消化和吹打步驟。

2、小細胞或原代細胞識別不準確 – 需要用戶根據經驗手動設定最小直徑和亮度閾值。

3、臺盼藍染色不均或過度染色 – 需嚴格控制染色時間和染料終濃度，不同批次臺盼藍存在差異。