伯樂（Bio-Rad）ChemiDoc 凝膠成像系統（特別是 ChemiDoc MP 型號，因為只有多熒光型號才涉及此問題），多通道熒光串擾是一個在實際操作中需要關注的技術現象。

簡單來說：串擾是指一個熒光通道（如綠色）檢測到了本應屬于另一個通道（如紅色）的熒光信號。

一、為什么會發生串擾？

1、光譜重疊：這是根本原因。不同熒光染料的發射光譜可能存在重疊區域。例如，Cy3（綠色通道檢測）和 Cy5（紅色通道檢測）的發射峰距離較遠，但某些染料的尾部發射會延伸到其他通道的檢測范圍內。

2、濾光片帶寬：ChemiDoc MP 使用的是特定的激發光LED和發射濾光片。濾光片無法實現“單色"透過，總有一定帶寬。如果濾光片帶寬覆蓋了其他染料的發射范圍，就會產生串擾。

3、強信號放大效應：當某一個通道的熒光信號非常強時，其微弱的尾部發射即使比例很小，也可能在另一個通道中被明顯看到。

二、不同型號情況不同

1、ChemiDoc MP（真正多熒光成像）：這是能進行多通道熒光成像的型號（支持RGB+遠紅，最多4通道）。它會有串擾問題，但系統內置了校正功能。

2、ChemiDoc XRS+ / Touch（基礎熒光型號）：這些型號通常只標配一個紫外激發透射臺和一個白光/藍光轉換屏，主要用于單通道熒光（如EB，GelGreen）或化學發光。它們不能做多通道熒光成像，因此不存在不同熒光通道間的串擾問題。如果你強行換濾光片做多色，需要手動處理。

三、如何解決 ChemiDoc MP 的串擾問題？

Bio-Rad 在 Image Lab 軟件 中提供了兩種有效的解決方案：

1、使用“串擾校正"（Crosstalk Correction）- 推薦常規使用

這是軟件內置的自動功能，利用純單染對照樣品計算校正矩陣。

操作步驟

（1）準備與實驗樣品相同的單染對照（例如：只含GFP的樣品、只含RFP的樣品、只含Cy5的樣品）。

（2）將單染對照放入系統，用相同的多通道采集程序分別成像。

（3）在 Image Lab 軟件的分析界面中，找到 “串擾校正" 或 “通道拆分校正" （具體位置可能在“圖像處理"或“分析設置"中）。

（4）軟件會根據單染對照的信號，自動計算各通道的串擾比例，并應用補償算法，輸出校正后的圖像。這個功能非常有效，可以將串擾降低至背景水平。

2、手動選擇“非重疊"的染料組合

如果不需要自動校正，可以從實驗設計上避免串擾。選擇光譜分離度好的染料。

推薦組合

（1）通道1 (Green)：FITC，GFP，Alexa 488

（2）通道2 (Red)：Cy3，Alexa 546

（3）更好的選擇：使用 Cy5 (遠紅通道) 與 GFP (綠通道) 組合，它們的重疊遠小于 GFP 和 Cy3。

（4）同時使用 GFP 和 YFP（黃色熒光蛋白）- 光譜幾乎重疊。

（5）同時使用 Cy3 和 TRITC - 發射光譜太接近。

3、調整曝光時間

如果某個通道信號過強（過飽和），其串擾會顯著增加。嘗試縮短強信號通道的曝光時間，或增加弱信號通道的曝光時間，但后者的串擾效應會更明顯。

四、總結建議

1、ChemiDoc XRS+ / Touch 做化學發光或單色熒光

是否串擾：無（不涉及多通道）

解決方案：無需處理

2、ChemiDoc MP 做多通道熒光

是否串擾：有，但可校正

解決方案：制備單染對照，在 Image Lab 軟件中執行 “串擾校正"

實驗設計：優先選擇 GFP + Cy5 這類遠距離組合，避免 GFP + Cy3

重要的提醒：不要試圖手動扣除背景或使用“圖像相減"來校正串擾。光譜串擾是非線性的，必須使用軟件內置的基于矩陣的校正算法。查看 Image Lab 軟件幫助文檔中的“Multiplex Fluorescence"章節，那里有詳細的操作截圖。